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本试剂盒是基于HiperClone快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒，可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点（相距超过50bp）同时引入定点突变。该试剂盒由两个模块组成：Hiper II Pfu DNA Polymerase扩增模块和HiperClone快速克隆模块。Hiper II Pfu DNA Polymerase超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性，其卓越的长片段扩增能力，广泛适用于长度小于20kb的任何质粒扩增。HiperClone快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应。因此使用本试剂盒进行DNA定点突变时，引物设计更加灵活，且扩增反应以指数方式进行，极大减少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的彻底降解。

本试剂盒中的重组酶Exnase MultiS经过优化，专门针对多碱基进行定点突变。此外，如扩增产物特异，其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率，使得本试剂盒成为DNA多点突变试剂盒。

• 引物设计时5’端反向互补区尽量选择无重复序列，且GC含量比较均匀的区域。当这一区域内GC含量在40%～60%范围之内时，重组环化效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组环化效率会受到较大影响。
  
• 如使用本品对质粒进行定点突变，请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌(例如Top10、DH5α、JM109)扩增原始质粒！
  
• 当两突变位点相距小于50bp时，应将其视为一个突变位点，将两突变引入同一条/对引物进行实验。
  
• DpnI只能识别甲基化DNA，请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板。
  
• 质粒PCR扩增结果需高度特异，杂带较多会影响实验结果。
  
• 重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(如EDTA)的带入。因此，建议将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH2O替代)，请勿使用TE进行DNA保存。
  
• 冷却后的反应产物应在1h内进行转化，且转化前保持在冰水浴中。如需储存，于-20℃冻存。尽量避免室温较长时间放置或4℃长期储存。
  
• 反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。另外，当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应。将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 引物设计
  向质粒三个不连续位点引入定点突变，只需设计三对引物将质粒分段扩增即可。引物设计基本原则为：在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩增引物对。每对正反向引物5’端包含15～21bp反向互补区域（GC含量40%～60%为佳），各引物待突变位点至引物3’端区域Tm值高于60℃为佳。所需引入突变可以包含在互补区域内(需要两条引物上均引入点突变)，也可以包含在任一条引物的非互补区域(只需在一条引物上引入点突变)，请勿将突变位点置于引物末端。以向pUC18引入三碱基突变为例，引物设计具体方案如图2所示。
  
  图2．向质粒引入不连续多碱基定点突变引物设计示意图
  注：待突变位点B、C处的正反向扩增引物设计方式与位点A处的引物设计方式一致。计算引物Tm值时，应计算待突变位点至引物3’端这一区域内的碱基，待突变位点至引物5’端区域内的碱基不应参与计算。
  
• 目标质粒分段扩增
  以待突变位点A、B、C为界，将质粒分为AB、BC段和CA段。使用Hiper II Pfu DNA Polymerase对各段分别进行扩增。AB段扩增引物对为：待突变位点A正向扩增引物和待突变位点B反向扩增引物；BC段扩增引物对为：待突变位点B正向扩增引物和待突变位点C反向扩增引物；CA段扩增引物对为：待突变位点C正向扩增引物和待突变位点A反向扩增引物。
  
  • 配制PCR反应体系
    反应各组分解冻后请充分摇匀，使用完毕后及时放回-20℃。2×Hiper II PCR buffer请勿长时间敞口放置。
    为了增加扩增特异性，反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止Hiper II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶最后加入反应体系中。
    推荐反应体系如下：
    

    成分	用量
    ddH2O	至50μL
    2×Hiper II PCR buffer	25μL
    dNTP Mix (10mM each)a	1μL
    模板DNAb	Optional
    引物1 (10μM)	2μL
    引物2 (10μM)	2μL
    Hiper II Pfu DNA Polymerase (1U/μL)c	1μL

    
    注：
    
    • 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
      
    • 在各片段能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量，推荐≤1ng。待扩增质粒长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，因此推荐使用新鲜制备的质粒作为模板。
      
    • 推荐的酶的终浓度为1U/50μL反应。可将Hiper II Pfu DNA Polymerase在0.5～2U/50μL之间进行优化，但不要超过2U/50μL，尤其当扩增子长度大于5kb时。
    
    
  • PCR扩增反应
    

    循环步骤	温度	时间	循环数
    预变性	95℃	30sec	1
    变性a 退火b 延伸c	95℃ 60℃～72℃ 72℃	15sec 15sec 30～60sec/kb	30d
    彻底延伸	72℃	5min	1

    
    注：
    
    • 对于大多数质粒，变性温度使用95℃即可。
      
    • Hiper II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。
      
    • 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。长的延伸时间有助于提高扩增产量。
      
    • 为了防止扩增过程中引入非目标突变，强烈建议扩增循环数≤35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数应≤30。
    
    反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测。如目标质粒正确扩增，则可进行下步实验。
• 扩增产物DpnI消化，去除甲基化模板质粒
  因上述扩增产物中包含原始模板质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行DpnI消化。
  推荐反应体系如下：
  

  成分	用量
  DpnI	1μL
  扩增产物	40～50μL

  
  将上述反应体系置于37℃恒温反应1～2小时。如产物扩增特异，产物条带单一，DpnI消化产物无需纯化，可直接用于后续重组反应。如扩增不特异，DpnI消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物。
  
• 重组反应
  
  • 配制重组反应体系
    质粒AB、BC和CA段扩增产物末端分别包含相对应的完全一致的一段序列，因此在Exnase MultiS催化下三扩增产物末端可以发生同源重组，完成扩增产物环化过程。于冰水浴中，将下列组分依次加到无菌的1.5mL Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘在管壁，请务必通过短暂离心使其沉入管底。体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。
    

    成分	用量
    ddH2O	Up to 20μL
    AB段DpnI消化产物	x ng
    BC段DpnI消化产物	x ng
    CA段DpnI消化产物	x ng
    2×HiperClone MultiS Enzyme Premix	10μL

    
    Exnase MultiS多点突变重组反应体系最适DNA使用量为每片段0.03pmol。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
    DpnI消化产物最适使用量= [0.02×目标质粒碱基对数] ng (0.03pmol)
    例如，AB段长度为1kb，BC段长度为2kb，CA段长度为5kb。则DpnI消化产物最适使用量为：AB段0.02×1000 = 20ng；BC段0.02×2000 = 40ng；CA段0.02×5000 = 100ng。
    注：DNA量太多或者太少都将降低环化效率。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差较大。因此，请务必通过琼脂糖电泳预先确认DNA浓度，尽量严格按照推荐量配制反应体系。当DpnI消化产物最适使用量计算值不足10ng或者超过200ng时，加入10ng或200ng即可。DpnI消化产物不纯化直接用于重组反应时，使用量不应超过反应总体积的1/5，即4μL。
    
  • 重组反应
    
    • 将上述体系置于50℃反应20～50min。
      
    • 待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。
      
    • 之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
• 反应产物转化、涂板、克隆鉴定
  
  • 取10μL冷却反应液，加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。
    
  • 42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。
    
  • 加入900μL SOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。
    
  • 37℃摇菌45min。
    
  • 取100μL菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
    注：我们推荐您使用转化效率＞10⁸ cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率<10⁸ cfu/μg (例如用CaCl₂法新鲜制备的感受态转化效率通常在10⁶-10⁷ cfu/μg之间)，请将培养菌液在5000rpm离心3min收集菌体，用100μL LB培养基重悬后全部涂板。